مقدمه

 

2 فصل اول: ی بر تحقیقات گذشته

 

  1- گیاهشناسی سیب زمینی

 

4 1-1) برگ

 

4 1-2) ساقه

 

4 1-3) غده

 

5 1-4) جوانه

 

5 1-5) ریشه

 

5 1-6) گل

 

5 2- ارقام سیب زمینی

 

5 2-1) رقم‌هاى خیلى ‌زودرس و زودرس

 

5 2-2) رقم­‌هاى متوسط رس یا میان‌رس

 

6 2-3) رقم­‌هاى دیررس

 

6 3- تاریخچه

 

7 4- مواد موجود در سیب زمینی

 

8 5- مراحل کشت سیب زمینی      

 

8 5-1) آماده كردن زمین برای كاشت سیب­زمینی

 

8 5-2) آماده‌کردن غده­‌ها براى کاشت سیب­زمینی

 

9 5-3) کاشتن غده­‌ها

 

10 5-4) آبیاری سیب زمینی

 

11 5-5) كوددهی سیب­زمینی

 

11        5 -6) وجین كردن و خاك دادن سیب­زمینی

 

12 5-7) برداشت

 

13 6- مراحل پس از برداشت و فرآوری سیب زمینی

 

14 7- اهمیت اقتصادی سیب­زمینی

 

15 8- ویروس­های بیماریزای سیب­زمینی

 

17 9- ویروس ایكس سیب­زمینی Potato virus X

 

20 9-1) آرایه­بندی

 

20 9-2) علائم

 

21 9-3) دامنه میزبانی طبیعی ویروس ایكس سیب­زمینی

 

22 9-4) گونه های میزبانی بكار رفته جهت تشخیص PVX

 

23 9-5) انتقال و انتشار ویروس

 

23 9-6) پراکنش جغرافیایی

 

24 9-7) خصوصیات ژنوم

 

24 9-8) خصوصیات پیكره ویروس

 

26 9-9) تکثیر ویروس ایکس سیب­زمینی در گیاه

 

27 9-10) تنوع ژنتیكی ویروس ایكس سیب­زمینی

 

28 10- روش­های ردیابی ویروس ایكس سیب­زمینی

 

30 10-1) سرولوژی

 

30 10-2) بررسی­های مولكولی واکنش زنجیره­ای پلی­مراز Polymerase Chain Reaction (PCR)

 

32 11- مطالعات انجام شده در ایران

 

37 12- هدف از این تحقیق

 

40 فصل دوم:مواد و رو ش­ها

 

  1- جمع آوری نمونه از مزارع سیب­زمینی

 

42 2- آزمون الایزا Enzyme-Linked Immunosorbent Assay- ELISA))

 

42 2-1) تهیه بافرها

 

42 2-1-1) بافرفسفات پتاسیم(PH, 7.4), (phosphate buffered saline-PBS)

 

43 2-1-2) بافر پوششی کربنات سدیم(PH, 9.6) , (Coating buffer)

 

43 2-1-3) بافر شستشو (PH,7.4),(Washing buffer)

 

پایان نامه و مقاله

 

 

43 2-1-4) بافر عصاره گیری (PH,7.4),(Extraction buffer)

 

43 2-1-5) بافر ترکیب پادتن-آنزیم (PH,7.4),(Conjugate buffer)

 

43 2-1-6) بافر زمینه (سوبسترا)(PH, 9.8),(Substrate buffer)

 

44 3- بررسی­های گلخانه­ای

 

45 4- بررسی انتقال

 

46 4-1) بررسی انتقال با سس

 

46 4-2) انتقال با تماس

 

46 5- بررسی خصوصیات مولكولی

 

46 5-1) استخراج آر.ان.ای (RNA Extraction)

 

46 5-2) واکنش زنجیره­ای پلی­مراز به روش رونوشت برداری برگردان (RT-PCR)

 

48 5-2-1) مرحله رونوشت برداری برگردان (Reverse transcriptase)

 

48 5-2-2) مرحله واکنش زنجیره ای پی. سی. آر

 

48 5-3) مشاهده محصول واكنش

 

49 5-4) خالص سازی قطعات تکثیر شده

 

49 5-4-1) جدا کردن قطعه ژل حاوی DNA تکثیر شده

 

49 5-4-2) حل کردن قطعه ژل و آزاد شده قطعه DNA

 

49 5-4-3)رسوب دادن DNA

 

50 5-4-4)شستشوی رسوب با بافر شستشو

 

50 5-4-5) حل شدن DNA در آب

 

50 5-6) آنالیز تبارازیی

 

51 6- خالص سازی ویروس PVX

 

53 7- اسپکتروفتومتری و تعیین غلظت ویروس جدا شده در آموده های(پرپارسیون) خالص شده

 

55 فصل سوم:نتیجه گیری

 

  1- بررسی علائم آلودگی­های موجود روی سیب زمینی

 

56 1-1) علائم آلودگی روی سیب زمینی

 

56 1-2) نشانه­ های آلودگی روی گوجه فرنگی

 

57 2- آزمون بیولوژیکی (واکنش گیاهان محک در مقابل عصاره حاوی ویروس ایکس)

 

58 2-1) گل تکمه­ایی Gomphrena globosa L.

 

58 2-2) داتوره Datura stramonium

 

59  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2-3) سلمکChenopodium amaranticolor 59
2-4) توتون Nicotiana glutinosa L 60
2-5) توتون Nicotiana tabacum. cv. White Burley 60
2-6) توتون Nicotiana tabacum. cv. Samsun 61
2-7) گوجه فرنگی Lycopersicum esculentum Mill 61
2-8) لوبیا Phaseolus vulgaris L.cv. Bountiful 61
2-9) باقلا. Vicia faba 61
2-10) ماش. Vicia sativa L. 62
2-11) دامنه میزبانی و علائم 62
3- درجه حرارت غیر فعال شدن (TIP) 63
4- آخرین حد رقت (DEP) 63
5- پایداری ویروس در شرایط آزمایشگاه (LIV) 63
6- مطالعه روش های انتقال 63
6-1) انتقال با سس 63
6-2) انتقال با تماس 63
7- خالص سازی 63
7-1) روشShepard, 1972 63
7-2) روشFribourg,1975 64
7-3) روشMoreira, 1980 65
8- تعیین پراکنش ویروس بر اساس آزمون الایزاELISA 65
9- بررسی خصوصیات مولكولی 72
9-1) نتایج حاصل از استخراج آر.ان.ای كل گیاه (RNA Extraction) 72
9-2) نتایج واکنش رونوشت برداری برگردان زنجیره­ای پلی­مراز
(RT-PCR)		 73
10) آنالیز تبازایی 74

 

 

 

 

 

فصل چهارم:بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات 76
فهرست منابع فارسی 84
فهرست منابع انگلیسی 85
چکیده انگلیسی 96

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول    
عنوان صفحه  
جدول1-1 اسامی ویروس های سیب زمینی

 

 

18

  
جدول 1-2 مقایسه بین ELISA, PCR, IC-PCR, RT-PCR-ELISA 35  
جدول1-3 توالی آغازگرهای استفاده شده برای سنتز cDNA جهت ردیابی ویروس ایكس سیب­زمینی 37  
جدول2-1 منطقه و تعداد نمونه های جمع آوری شده از مزارع سیب زمینی در همدان 42  
جدول2-2 گیاهان میزبانی که برای مایه زنی ویروس ایکس سیب زمینی استفاده شد 45  
جدول2-3 آغازگرهای استفاده شده در آزمون RT-PCR 49  
جدول2-4 لیست توالی‌های کامل پروتئین پوششی PVX موجود در بانك ژن كه برای مقایسه با جدایه‌های ایرانی مورد استفاده قرار گرفته‌اند 52  
جدول3-1درصد نمونه های علائم دار جمع آوری شده از مزارع همدان 57  
جدول3-2 علائم ویروس ایکس بروی گیاهان محک 62
جدول 3-3 درصد آلودگی به چهار ویروس PVX، PVY، PVS و PLRV در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ 65  
جدول3-4 درصد آلودگی همزمان در مزارع استان همدان 66  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست نمودارها  
عنوان صفحه
نمودار1-1 توزیع میزان تولید سیب زمینی در استانهای كشور 16
نمودار3-1(Shepard, 1972) Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation 64
نمودار3-2(Fribourg,1975)   Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation 64
نمودار3-3 Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation(Moreira,1980) 65
نمودار3-4 نمودار 3-4درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی منطقه بهار 68
نمودار3-5 درصد آلودگی در مزارع سیب زمینی در منطقه رزن 69
نمودار3-6 درصد آلودگی مزارع سیب زمینی در منطقه کبودر آهنگ 71
نمودار3-7 درصد آلودگی ویروس های سیب زمینی در مزارع سیب زمینی استان همدان 72

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  فهرست اشکال  
عنوان صفحه
شكل1-1 ویروس PVX همراه با ویروس TMV حالت هم افزایی داشته و علائم شدید Double streak را ایجاد می­ کند 21
شكل1-2 گیاه سیب زمینی آلوده به ویرو س ایكس سیب زمینی با علائم موزاییك 22
شکل1-3 مدل حرکت Potexivirus 26
شكل1-4 مقایسه حساسیت روش های RT-PCR(A) و DAS-ELISA (B) برای ردیابی ویروس ایکس سیب زمینی 34
شکل 3-1 علائم موزائیک و نکروز در بوته سیب زمینی آلوده به دو ویروس ایکس و وای سیب زمینی 57
شکل 3-2 نمونه گوجه فرنگی مشکوک به علائم ویروسی 58
شکل3-3 لکه های نکروز، 15 روز پس از مایه زنی عصاره حاویPVX روی گل تکمه ایی 58
شکل3-4 لکه های سبز روشن پس از 10 روز مایه زنی عصاره حاویPVX روی داتوره 59
شکل3-5 ظهور لکه های سبزرد( کلروتیک) (سمت راست) و سپس سیستمیک در گیاه سلمک (سمت چپ) 59
شکل3-6 لکه­های سبزرد (کلروتیک) و موزاییک روی برگ N.glutinosa L مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX 60
شکل3-7علائم پیسك (ماتل)و رگبرگ روشنی روی Nicotiana tabacum. cv.White Burley مایه زنی شده توسط جدایه PVX 60
شکل3-8 علائم لكه های كلروز و نكروز سیستمیک در گیاه گوجه فرنگی 12 روز بعد از مایه زنی توسط PVX 61
شکل3-9 علائم زردی و موزائیک روی برگ­های ماش مایه زنی شده توسط عصاره حاویPVX 62
شکل3-10 عکس از باند حاصل شده ازRNA استخراج شده بروش Tri-Reagent 73
شكل 3-11 الكتروفورز محصولات PCR مربوط به تكثیر پروتئین پوششی با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی، در ژل آگاروز یک درصد 74
شکل 3-12 درخت تبارزایی جدایه‌های ایرانی PVX با سایر جدایه‌ها كه با روش NJ و 100 مرتبه bootstrap بدست آمده است. 75

 چکیده:

ویروس ایکس سیب­زمینی (Potato virus X- PVX) گونه شاخص جنس Potexvirus از خانواده Alfaflexiviridae می­باشد. طی سال های 1389 و 1390، از مناطق کشت اصلی سیب زمینی در استان همدان بازدید و نمونه برداری انجام گرفت. مجموعاً 456 نمونه برگی (تعداد 132 و 324 نمونه بترتیب علائم­دار و تصادفی) از 9 مزرعه واقع در مناطق بهار، کبودرآهنگ و رزن جمع آوری گردید. نتایج آزمون الایزا با بهره گرفتن از آنتی بادی اختصاصی (بیوربا-سویس) نشان دهنده آلودگی 42 نمونه با ویروس ایکس سیب زمینی بود. بر اساس آزمون الایزا میزان وقوع آلودگی به این ویروس به ترتیب کاهش در مناطق بهار، رزن و کبودرآهنگ تعیین گردید. برای تایید نتایج حاصل از آزمون سرولوژیکی از روش های بیولوژیکی و مولکولی استفاده شد. مطالعه دامنه میزبانی جدایه های ایرانی ویروس ایکس سیب زمینی با بهره گرفتن از گیاهان محک مختلف، تفاوتی نشان داد. همچنین در این تحقیق ناحیه ژن پروتئین پوششی ویروس بطول حدود 750 جفت باز با بهره گرفتن از آغازگر های اختصاصی تکثیر گردید. آنالیز تبارزایی با بهره گرفتن از توالی کامل پروتئین پوششی دو جدایه ویروس شامل Iran H1 و Iran H2 با توالی‌های مربوط به جدایه های خارجی PVX موجود در بانک ژن نشان داد که جدایه های ایرانی در گروه اروپا-آسیا (Eurasia) قرار می گیرند. در درخت تبارزایی جدایه های تعیین توالی شده در این بررسی با جدایه ویروس ایکس جدا شده از نخود (Pisum sativum) در یک شاخه مستقل و نزدیک بهم قرار گرفتند. طول کامل توالی پروتئین پوششی 714 نوکلئوتید بود که پروتئینی با 237 اسیدآمینه تولید می نماید. این نتایج با نتایج بدست آمده در مورد سایر جدایه های این ویروس از مناطق دیگر دنیا مطابقت دارد. هر چند که جدایه های ایرانی مورد مطالعه در گروه اروپا-آسیا قرار می گیرند ولی هنوز مشخص نیست که آنها جدایه های غالب این ویروس در ایران باشند. برای این منظور لازم است تا جدایه های بیشتری از این ویروس از مناطق خاورمیانه و سایر کشورها تعیین توالی شوند. هر چند بر اساس مطالعات ما این اولین گزارش از آنالیز تبارزایی این ویروس جدا شده از سیب زمینی از ایران واقع در منطقه mid-Eurasia می باشد.

كلمات كلیدی: ویروس ایكس سیب زمینی، تبارزایی، ایران

مقدمه:

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...