فصل اول: ی بر پیشینه ی تحقیق

مقدمه. …………………………………………………………………………………………………………….. . 2

اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………. .3

جنس ا ستافیلوکوکوس……………………………………………………………………………………….. .5

طبقه‌بندی استافیلوکوکوس ا ورئوس………………………………………………………………………. .5

استافیلوکوکوس اورئوس……………………………………………………………………………………… 7

مورفولوژی……………………………………………………………………………………………………….. .7

ویژگی‌های ساختمانی. ………………………………………………………………………………………… .7

ویژگی های بیولوژیکی و بیوشیمیایی……………………………………………………………………… ..8 پتیدوگلیگان       9

پلی سارکارید……………………………………………………………………………………………………. .10

اسیدتیکوئیک……………………………………………………………………………………………………. . 10

پروتئین. A……………………………………………………………………………………………………….. 11

فیزلوژی…………………………………………………………………………………………………………… .11

خصوصیات کشت …………………………………………………………………………………………….. ..11

متابولیسم………………………………………………………………………………………………………….. .12

شناسایی بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………. . 13

روش های طبقه بندی………………………………………………………………………………………….. . 13

تعیین تیپ با باکتریوفاژ………………………………………………………………………………………. .13

تعیین انواع ………………………………………………………………………………………………………. . 14

ژنتیک…………………………………………………………………………………………………………….. .14

مقاومت…………………………………………………………………………………………………………… .15

عوامل موثر در بیماریزایی…………………………………………………………………………………….. . 15

گیرنده های پروتئینی………………………………………………………………………………………….. .16

آنزیم های خارج سلولی……………………………………………………………………………………….. .16

گوآکولاز………………………………………………………………………………………………………… 17

فاکتور کلامپینگ………………………………………………………………………………………………. 17

علت پلی مورفیسم کوآگولاز………………………………………………………………………………… .18

لیپازها…………………………………………………………………………………………………………….. .18

هیالورونیداز……………………………………………………………………………………………………… .18

استافیلوکیناز (فیبرینولیزین) ………………………………………………………………………………… 19

نوکلئاز مقاوم به حرارت………………………………………………………………………………………. .19

توکسین های سیتولیتیک……………………………………………………………………………………… .19

توکسین آلفا (همولیزین-آلفا )……………………………………………………………………………… .19

توکسین بتا (اسفنگومیلیناز)………………………………………………………………………………….. .19

توکسین دلتا……………………………………………………………………………………………………… .19

توکسین گاما…………………………………………………………………………………………………….. .20

لکوسیدین………………………………………………………………………………………………………… .20

توکسین ها ……………………………………………………………………………………………………… 21

پایداری انتروتوکسین ها در برابر حرارت…………………………………………………………………. ..22

تولید انتروتوکسین……………………………………………………………………………………………… . 23

توکسین اکسفولیاتیو…………………………………………………………………………………………… .23

بیماریزایی خارج روده ای…………………………………………………………………………………….. .23

مسمومیت غذایی استافیلوکوکوس…………………………………………………………………………… 20

علایم مسمومیت غذایی………………………………………………………………………………………… .25

فصل دوم: روش تحقیق

مواد و روش کار……………………………………………………………………………………………….. ..27

محیط های کشت ……………………………………………………………………………………………… 27

محیط غنی کننده……………………………………………………………………………………………….. . 27

محیط انتخابی…………………………………………………………………………………………………….. .28

تست های تاییدی. …………………………………………………………………………………………….. ..30

تست کاتالاز…………………………………………………………………………………………………….. .30

تست گلوکز…………………………………………………………………………………………………….. .30

تست مانیتول…………………………………………………………………………………………………….. .30

تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………………. .31

مشاهده میکروسکوپی………………………………………………………………………………………….. .32

نحوه نمونه برداری……………………………………………………………………………………………… .32

آماده کردن نمونه جهت انجام آزمایش. ………………………………………………………………….. .32

استخراج DNA………………………………………………………………………………………………….. .33

تعیین کیفیت DNA با بهره گرفتن از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز………………………………… . 34

تعیین کمیت و کیفیت DNA با بهره گرفتن از اسپکتروفتومتری………………………………………. 34

واکنش زنجیره ای پلی مرازی……………………………………………………………………………….. 35  

الکتروفورز فرآورده های PCR …………………………………………………………………………… 36

تفکیک قطعات تکثیریافته. ………………………………………………………………………………….. . 37

بارگذاری محصولات تکثیر شده……………………………………………………………………………… ..37

فصل سوم:نتایج تحقیق

نتایج شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس با کشت……………………………………………………….. ..32

نتایج تعیین کیفیت DNA با بهره گرفتن از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز …………………………. 41

نتایج انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز براساس ژن Coa ……………………………………………. . 42

نتایج تعیین توالی……………………………………………………………………………………………….. ..43

فصل چهارم:بحث و نتیجه گیری

نتیجه گیری وپیشنهاد………………………………………………………………………………………….. . 51

فهرست منابع…………………………………………………………………………………………………….. 95

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………. .98

جدول 1-1- اسامی گونه های شناسایی شده استافیلوکوکوس…………………………………………. .6

جدول 2-1- خصوصیات بیوشیمیایی استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه باسایر…………………. .. 9

جدول 3-1- صفات متمایز کننده و تشخیص استافیلوکوکوس و میکروکوکوس………………… . 9

جدول 1-2-ترکیب ومقدار مواد تشکیل دهنده ی محیط کشت گوشت پخته نمک دار……….. 27

جدول2-2- ترکیب ومقدار مواد تشکیل دهنده ی محیط کشت برد پارکر آگار                 29

جدول 3-2- غلظت مواد تشکیل دهنده لیز بافر…………………………………………………………. 34

جدول 4-2-اجزای واکنش زنجیره ای پلی مراز………………………………………………………….. .36

جدول 5-2-پرایمرهای مورد استفاده……………………………………………………………………….. .36

جدول 6-2- نحوه تهیه یک بافر TAE 50 X…………………………………………………………….. 37

جدول 7-2- بافر لودینگ 6X ………………………………………………………………………………. 37

جدول 8-2- محلول های مورد نیاز برای الکتروفورز ژل آگاروز                                    39

جدول 1-3- توزیع فراوا نی و درصدی نمونه های مورد آزمایش                                    39

جدول 2-3-توزیع فراوانی نتایج کشت برحسب نوع شیر در 103 نمونه مورد آزمایش           40

جدول 3-3- آلودگی نمونه ها برحسب سن پنیر در 103 نمونه مورد مطالعه                        40

جدول 4-3- آلودگی نمونه ها برحسب نوع پنیر در 103 نمونه مورد مطالعه                       40

جدول 5-3- نتایج نهایی نمونه های پنیر مورد بررسی از نظر رشد باکتری در 103 نمونه موردمطالعه   41

تصویر-1-1- تشکیل پرگنه های سیاه در محیط کشت برد پارکر آگار                            56

تصویر3-1- الکتروفورز DNA های استخراج شده……………………………………………………… 59

تصویر3-2- الکتروفورز محصول PCR ژن coa در آگاروز 5/1 درصد…………………………… 60

چکیده

استافیلوکوکوس اورئوس به عنوان سومین عامل مهم بیماری های با منشاء مواد غذایی مطرح می باشد. شیر ماده ای اولیه منا سب جهت رشد استافیلوکوکوس اورئوس بوده و فراورده های شیری منبع شناخته شده ای برای مسمومیت های استافیلوکوکی است.

این مطالعه جهت تعیین میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس در پنیرهای محلی انجام شده است. مجموعا 103 نمونه بطور تصادفی از روستاهای اطراف ملکان و میاندوآب جمع آوری و با روش ها کشت و PCR مورد آزمایش قرار گرفتند.

براساس نتایج این مطالعه 7 مورد (6/11 درصد) از نمونه ها آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بودند و 7مورد دیگر(6/11درصد) از نمونه ها آلوده به استافیلوکوکوس اینترمدیوس بودند وبراساس نتایج بدست امده در این مطالعه 2 /23 درصد از نمونه ها استافیلوکوکوسهای کواگولاز مثبت آلوده بودند و8/76 درصد از نمونه ها به استافیلوکوکوسهای کواگولاز منفی آلوده بودند.

نتایج این تحقیق نشان داد که رعایت شرایط بهداشتی در حین تولید الزامی است و استفاده از شیر پاستوریزه در تهیه پنیر دارای اهمیت می باشد.

کلمات کلیدی: پنیر محلی – استافیلوکوکوس اورئوس- کشت – PCR – ملکان و میاندوآب.

مقدمه:

پنیر از مهمترین پدیده های بشری است که در تغذیه بشر، سهم بسزائی دارد و ضمن تامین مواد لازم جهت رشد، در مطبوع ساختن غذای روزانه موثر است. در مناطق روستایی و عشایری به علت عدم وجود سردخانه جهت نگهداری شیر و طعم مطبوع پنیرهای سنتی، ساخت و مصرف این فرآورده متداول است.

از آنجایی که پنیر یکی از فرآورده‌های مهم شیر مورد مصرف در کشور است و مصرف پنیر سنتی نیز در بسیاری از نقاط کشور رواج دارد، آلودگی میکروبی آن باید مورد توجه قرار گیرد.

پنیرهای محلی تولید شده به چند دسته تقسیم می شوند که مبنای آن شیر حیوان نظیر پنیر گاومیش، گاو، گوسفندی، بزی و مخلوط (شیرگاو+شیرگوسفند) است که پنیراز ان تهیه می شود.

جنس ا ستافیلوکوکوس یکی از باکتریهای حائز اهمیت در بهداشت مواد غذایی و بیماریهای انسانی ودامی است. از گونه های مختلف این جنس برخی ایجاد کننده مسمومیت های غذایی، برخی عامل ایجاد زخمهای پوستی، دمل وبرخی باعث ایجاد عفونتهای بیمارستانی بسیار خطرناک هستند وگاهی مقاوم به درمان می شوند.استافیلوکوکوس یکی از جنس های با کتریایی فرصت طلب سطوح بدن جانداران خونگرم است. مهمترین مساله از نظر بهداشت عمومی بویژه از نظر بهداشت مواد غذایی، مسمومیت غذایی است که بوسیله انتروتوکسین تولید شده توسط St.aureus ایجاد می شود.

خصوصیات مسمومیت ایجاد شده بوسیله استافیلوکوکوس اورئوس عبارتند از: دوره کمون کوتاه 30 دقیقه تا 8 ساعت، استفراغ، درد و انقباضات شکمی،نبض ضعیف، تعریق،کاهش حرارت بدن.در این مسمومیت مرگ و میر بسیار نادر است و بهبودی طی 24تا48 ساعت رخ می دهد.این مسمومیت یکی از شایع ترین مسمومیت های غذایی در جهان است و در اکثر کشورها جزو 3 عامل اول مسمومیتهای غذایی است (6،10).

این باکتری معمولا نه تنها در مواد غذایی خام بلکه در مواد غذایی پردازش شده باعث مسمومیت می‌شود. غذاهای عامل این مسمومیت می توانند فرآورده های پروتئینی، طیور و فرآورده های ماهی، فرآورده های شیر، سسهای کرم دار، سالاد در انواع مختلف، شکلات صبحانه و شیرینی های خامه ای باشند. در این غذاها بدلیل آنکه در طی فرایند تهیه آنها میکروب های رقیب تضعیف می شوند محیط برای رشد استافیلوکوکوس مهیا می‌شود (6).

روش‌های کشت که برای جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس کوآگولاز مثبت مورد استفاده قرار می گیرند زمان بر بوده و ظاهرا در نتایج حاصله از آنها پاسخ های مثبت کاذب مشاهده می شود. در مطالعات اخیر روش های جدید با بهره گرفتن از واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR)[1]کارآئی خوبی نشان داده ا ند.

لذا بدلیل اهمیت موضوع، مطالعه حاضر جهت تعیین میزان شیوع استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت در پنیرهای محلی براساس روش های کشت و PCRانجام شد.

اهداف تحقیق